Waterspitsmuis en eDNA – vergelijking analyseresultaten van twee laboratoria

Om te toetsen hoe consequent en betrouwbaar laboratoriumanalyses van environmental DNA-monsters zijn, zijn 121 duplomonsters in twee laboratoria onderzocht op de aanwezigheid van DNA van de waterspitsmuis. De gemiddelde resultaten komen goed overeen tussen de twee laboratoria.

Geschreven door Sil Westra (Silvavir Ecologisch Advies), Anna van der Veen (Wetterskip Fryslan), Kees van Bochove (Datura Moleculair Solutions)

Download hier de pdf van dit artikel:

De waterspitsmuis (Neomys fodiens, zie afbeelding 1) is de grootste spitsmuis van Europa en komt voor langs wateren met een rijke vegetatiestructuur en in moerasgebieden. In Nederland is de soort beschermd onder de Omgevingswet. Dat betekent dat er een omgevingsvergunning nodig is wanneer activiteiten mogelijk negatieve effecten hebben op het dier. Om vast te stellen of activiteiten, zoals ruimtelijke ingrepen, effecten zullen hebben is ecologisch onderzoek noodzakelijk naar de aanwezigheid van de soort.

De laatste jaren worden er verschillende onderzoeksmethoden toegepast waarvan tot voor kort de trefkansen niet goed genoeg bekend waren. In 2022 en 2023 is er een grootschalig veldonderzoek uitgevoerd naar de trefkans van verschillende methoden om waterspitsmuizen te inventariseren. In dit onderzoek werd geconcludeerd dat environmental DNA (eDNA) ongeveer even effectief is als alternatieve methoden met wildcamera’s of inloopvallen [1]. Die uitkomst betekent dat eDNA in de toekomst nog breder zal worden ingezet als onderzoeksmethode naar de verspreiding van de waterspitsmuis.

Environmental DNA is een relatief nieuwe methode voor verspreidingsonderzoek, waarbij in een laboratorium kan worden bepaald of er in water- of bodemmonsters uit het veld DNA van een specifieke soort aanwezig is. Waar echter nog veel onduidelijkheid over heerst is de afbraaksnelheid van het DNA onder verschillende omstandigheden en hoe consequent en betrouwbaar de labanalyses in verschillende laboratoria zijn. Om dit te toetsen zijn de resultaten van analyses van identieke water- en bodem-eDNA-monsters vergeleken in twee verschillende laboratoria. Dit is enerzijds gedaan met in duplo afgenomen veldmonsters. Anderzijds met blind aangeleverde labmonsters geprepareerd in een derde onafhankelijk laboratorium op basis van synthetisch eDNA-extract; een zogeheten spiking-experiment.

Veldmonsters
Op 69 kansrijke locaties voor de waterspitsmuis, zoals het Fochtelooërveen  (zie afbeelding 2), zijn eDNA-water- en -bodemmonsters in tweevoud afgenomen. Vervolgens zijn er labanalyses uitgevoerd in twee separate laboratoria van Wetterskip Fryslân (Leeuwarden) en Datura Moleculair Solutions (Wageningen) en zijn de resultaten met elkaar vergeleken. Tijdens het onderzoek in het voorjaar en najaar van 2022 werden op 69 locaties in totaal 34 watermonsters en 39 bodemmonsters afgenomen, allen in duplo (zie afbeelding 3).

Spiking-experiment

In een zogeheten spiking-experiment is geprobeerd de eDNA-methode verder te toetsen en de uitkomsten van verschillende laboratoria met elkaar te vergelijken. Hiervoor werd in een gecontroleerde omgeving waterspitsmuis-DNA toegevoegd aan blanco water- en bodemmonsters en werden deze ‘gespikete’ labmonsters blind aangeleverd bij laboratoria voor labanalyses. In oktober 2022 werden 24 watermonsters van 1 liter afgenomen uit een onnatuurlijke vijver in Bennekom (Gelderland) waar vrijwel zeker geen waterspitsmuizen voorkomen. Ook werden er in maart 2023 in de Hoekse Waard 24 bodemmonsters verzameld. Deze locatie werd gekozen omdat er op dit eiland betreft al meer dan 25 jaar geen enkele waterspitsmuis is waargenomen [2].

De monsters zijn afgenomen volgens protocollen en met sampling kits van Datura Moleculair Solutions [3], [4]. Aan de monsters werden in het laboratorium van Wageningen Environmental Research (WENR) in 2022 en 2023 onder gecontroleerde omstandigheden drie verschillende concentraties waterspitsmuis-DNA toegevoegd, gekwantificeerd als geen, laag, middel en hoog. Voor dit ‘spiken’ leverde het lab van Datura een synthetisch fragment van waterspitsmuis-DNA aan met een concentratie van 10.000 moleculen per µl (DNA-extract). De concentraties in de voor het experiment gebruikte verschillende water- en bodemmonsters zijn 0, 50, 250 en 1000 moleculen waterspitsmuis-DNA per monster (zie tabel 1). De monsters werden door WENR genummerd, geadministreerd en vervolgens blind en willekeurig door elkaar opgestuurd naar de laboratoria van Wetterskip Fryslân en Datura voor analyse.

Tabel 1. Typen monsters en concentraties eDNA die blind zijn geanalyseerd

Labanalyses

In totaal hebben zowel het Wetterskip als Datura 58 watermonsters (34 veld en 24 spike) en 63 bodemmonsters (39 veld en 24 spike) geanalyseerd. De isolatie van de bodemmonsters werd uitgevoerd met de ‘Datura extractie-bodemkit’. De isolatie van de gefiltreerde watermonsters werd in het laboratorium geanalyseerd met behulp van de fenolchloroformisolatie-methode [5]. De detectie en kwantificatie van het geïsoleerde DNA uit bodem- en watermonsters werd bepaald met de quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-methode, een kettingreactietechniek die wordt gebruikt om een specifiek DNA-segment te vermenigvuldigen [6]. Hierbij wordt gebruik gemaakt van soort-specifieke primers en probes [7]. Dit zijn synthetische stukjes DNA die uitsluitend aan het DNA van de doelsoort binden en dit zichtbaar maken door fluorescentie (zie afbeelding 4). De analyse werd uitgevoerd met twaalf PCR-replica’s per sample, waarbij gebruik werd gemaakt van de TaqMan Environmental Mastermix 2.0 [8]. De waterspitsmuis wordt als ‘aanwezig’ beschouwd als ten minste één van deze twaalf replica’s positief was.

Resultaten
De resultaten zijn gerapporteerd in het percentage positieve PCR-replica’s, zogeheten wells. De waardes van het aantal positieve wells zijn gekwantificeerd, door het aantal positieve wells te delen door het totaal aantal van twaalf wells per sample.

In afbeelding 5 zijn de resultaten van de beide laboratoria van de watermonsters uit het spiking-experiment weergegeven. Te zien is dat er bij een lage concentratie minder wells positief zijn dan bij de middelhoge en hoge concentratie.

In afbeelding 6 zijn de resultaten van de beide laboratoria van de bodemmonsters uit het spiking-experiment weergegeven. Te zien is dat ook hier bij een lage concentratie minder wells positief zijn dan bij de middelhoge en hoge concentratie. De middelhoge en hoge concentratie eDNA geven bij Datura hetzelfde resultaat. Bij Wetterskip Fryslân is er wel een verschil tussen de beide concentraties.

In afbeelding 7 zijn de resultaten van de veldmonsters (39 duplo-bodemmonsters en 34 duplo -watermonsters) weergegeven, die in 2022 zowel door Wetterskip Fyslân als door Datura zijn getest. Ook hieruit blijkt dat de resultaten van de twee laboratoria overeenkomen.

Met behulp van een binomiale GLM (Generalized Linear Model) is bepaald of het aantal positieve replica’s significant verklaard kan worden door het laboratorium dat de test heeft uitgevoerd of door de hoeveelheid eDNA die aan het monster is toegevoegd. Hieruit blijkt dat zowel voor de watermonsters als voor de bodemmonsters die resultaten niet significant anders waren bij de verschillende laboratoria. Wel werd het aantal positieve replica’s statistisch significant positief beïnvloed door de hoeveelheid eDNA dat aan de monsters is toegevoegd.

Dit is aanvullend statistisch getest met een Wilcoxon signed-rank test. Als deze test een p-waarde geeft < 0,05, is er sprake een significant verschil is tussen de laboratoria. Bij geen van de resultaten is een significant verschil vastgesteld tussen de laboratoria (Watermonsters: V = 50,5, p = 0,379, n = 34. Bodemmonsters: V = 102, p = 0,236, n = 39).

Conclusie en discussie

Er heerst onduidelijkheid over hoe consequent en betrouwbaar eDNA-analyses zijn tussen verschillende laboratoria. De uitkomsten van de eDNA-analyses uit het experiment zoals hier beschreven, geven geen significante verschillen tussen twee verschillende Nederlandse laboratoria. Belangrijk om hierbij te benoemen is dat de resultaten van de labmonsters in het spiking-experiment (48 van 121 monsters) nadrukkelijk een laboratoriumverslag zijn.

Het opzetten van een ogenschijnlijk eenvoudig laboratoriumexperiment zorgde voor uitdagingen. De neutraliteit van de te spiken basismonsters bijvoorbeeld. Hoe weet je zker dat er niet op voorhand al waterspitsmuis-DNA aanwezig is in het monster? Zo werden er in eerste instantie 24 monsters uit een zak potgrond genomen. Deze bodemmonsters bevatten echter veel te veel droog materiaal en konden hierdoor in de praktijk niet in de laboratoria geanalyseerd worden. Het experiment is hierdoor voor bodemmonsters in eerste instantie mislukt. Hierop is besloten een tweede maal separaat bodemmonsters te verzamelen in een gebied met aangetoonde afwezigheid van waterspitsmuizen, langs de Oude Maas in de Hoekse Waard. Naturalis Biodiversity Center leverde op verzoek van de auteurs waterspitsmuisweefsel aan om monsters te spiken, maar het bleek niet werkbaar om hier DNA uit te extraheren voor dit experiment. We hebben daarom monsters gemaakt waar verschillende concentraties synthetische waterspitsmuis-DNA-moleculen aan zijn toegevoegd, waarvan we weten dat de PCR die zou moeten kunnen oppikken. Dat lukt en hoe meer DNA in het monster, hoe groter de slagingskans. Maar als het gaat om praktijktoepassing, hebben we feitelijk geen enkel idee hoe de spike-concentraties zich verhouden tot daadwerkelijke eDNA-concentraties van in het veld genomen monsters. Het is een wilde gok. Dit vraagt om een vervolg. Voor een representatief en realistisch spiking-experiment is het relevant om te weten hoe die twee concentraties zich verhouden.

De concentratie van eDNA in bodem of water is onder andere afhankelijk van de hoeveelheid DNA dat een organisme afgeeft en de snelheid van afbraak in het milieu. Beide zijn zeer waarschijnlijk afhankelijk van complexe interacties tussen omgevingsomstandigheden, het metabolisme en de ecologie van de doelsoorten [9]. Hogere omgevingstemperaturen versnellen de afbraak van DNA door hogere activiteit van enzymen en micro-organismen die DNA afbreken. Ook sediment kan van invloed zijn op het behoud van DNA, door zowel DNA-moleculen te binden en te beschermen als door extracellulaire nucleasen te binden en te inactiveren. Het is daarom belangrijk om bij de bemonstering rekening te houden met de poriegroottes van het filter en de hoeveelheid water die wordt verzameld om een zo efficiënt mogelijke analyse uit te voeren.

Uit een eerdere studie bleek dat de detectiekans voor waterspitsmuis in het najaar groter is [1]. Waarschijnlijk komt dat doordat de populatiedichtheid van waterspitsmuizen in die periode het grootst is. Voor andere soorten worden ook de beste resultaten behaald wanneer monsters in het veld worden verzameld op een piek met seizoensgebonden activiteiten [10]. Niet alleen de periode van het jaar maar ook de microhabitat waarin de (bodem)monsters worden afgenomen hebben naar inschatting een grote invloed op het resultaat. Kortom, de deskundigheid en kennis van de ecologie van de doelsoort(en) bij de veldwerker zorgt voor een effectievere afname van monsters in het veld en dus een hogere trefkans van eDNA in het lab.

Dankwoord
Dit experiment en artikel zijn tot stand gekomen dankzij de hulp van Ivo Laros en Arjen Groot van Wageningen Environmental Research (WENR) en Theun Tamsma van Wetterskip Fryslân. Veel dank gaat uit naar Merijn van den Hoogenhof en vrijwilligers van bezoekerscentrum Klein Profijt in de Hoekse Waard voor het belangeloos verzamelen van bodemmonsters. Becky Desjardin van Naturalis Biodiversity Center was erg behulpzaam door weefsel van waterspitsmuizen uit de natuurhistorische collectie in Leiden naar ons op te sturen.

Samenvatting
Om te toetsen hoe consequent en betrouwbaar laboratoriumanalyses van environmental DNA-monsters zijn, zijn 121 duplomonsters in twee laboratoria onderzocht op de aanwezigheid van DNA van de waterspitsmuis. De gemiddelde resultaten van de watermonsters komen goed overeen tussen de twee laboratoria. In de bodemmonsters is meer variatie waargenomen, maar uit de analyse komt naar voren dat er geen statistisch significant verschil is tussen de uitkomst van de twee laboratoria.

REFERENTIES
1.      Westra, S.A. et al. (2024). ‘Waterspitsmuizen aantonen kan op vier manieren’. De Levende Natuur 125-5, p. 182-187  

2.      Van den Hoogenhoff, M. (2023). Is het een goed of slecht muizenjaar? Vijfentwintig jaar braakbalonderzoek in de Hoeksche Waard. Zoogdier 30(2), p.23-25.

3.      Datura Moleculair Solutions (2024). eDNA bodemsamplingprotocol.

4.      Datura Moleculair Solutions (2024). eDNA filter samplingprotocol.

5.      Datura Moleculair Solution (2020). eDNA phenol-chloroform DNA extractie protocol.

6.      Kralik, P., & Ricchi, M. (2017). ‘A Basic Guide to Real Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything’. Frontiers in Microbiology, p. 108.

7.      Datura Moleculair Solutions (2020). Handleiding: qPCR-kit Waterspitsmuis. Wageningen.

8.      ThermoFisher (2022). TaqMan™ Environmental Master Mix 2.0. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4396838?SID=srch-hj-4396838, geraadpleegd op 3  juni 2025.

9.      Barnes, M. A., Turner, C.R. (2016). ’The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics’. Conservation Genetics 17: 1-17. https://doi.org/10.1007/s10592-015-0775-4

10.  De Souza, L.S., Godwin, J.S., Renshaw, M.A. , Larson, E. (2016). ‘Environmental DNA (eDNA) Detection Probability Is Influenced by Seasonal Activity of Organisms’. PLOS ONE 11(10)  p.1-15